荧光定量pcr 荧光定量pcr技术

关于荧光定量pcr，荧光定量pcr技术这个很多人还不知道，今天小篇来为大家解答以上的问题，现在让我们一起来看看吧！

1、实时荧光定量PCR 1996年，实时荧光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR) 由美国Applied Biosystems公司首先推出，所谓Real-time qPCR是指在 PCR反应中加入荧光基团 ，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及 信号强弱的变化 ，即时分析 目的基因的初始量 ，该技术的发明实现了 PCR从定性到定量的飞跃 。

2、 荧光化学物质 目前根据Real-time qPCR所使用荧光化学物质不同，将其分为 荧光染料和荧光探针 两类。

3、 荧光化学物质发光原理 荧光染料 荧光染料也称DNA结合染料，目前主要使用的染料分子是 SYBR Green I ，SYBR Green I能与 DNA双链的小沟特异性的结合 ，游离的SYBR Green I几乎没有荧光信号，但结合双链DNA后，其荧光信号可呈数百倍的增加。

荧光定量pcr 荧光定量pcr技术

4、随PCR产物的增加，PCR产物与染料的结合量也增大，其 荧光信号强度代表双链DNA分子的数量 。

5、 荧光染料的优点： 使用简便； 可以与任何PCR产物结合； 价格便宜； 荧光染料的缺点： 不能区分不同的双链DNA 引物二聚体会影响检测的敏感性 非特异性产物会影响结果的敏感性 引物二聚体和非特异性扩增问题可以通过 熔解曲线 (Melting curve) 进行识别，进而通过 PCR引物的设计和反应条件的优化 得以解决。

6、 总的来说，SYBR Green I方法是一种最基础也最常用的Real-time qPCR实验手段。

7、 荧光探针 Real-time qPCR中最常用的荧光探针为 TaqMan探针 ，其基本原理是依据目的基因设计合成一个能够与之特异性杂交的探针，该探针的 5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团 。

荧光定量pcr 荧光定量pcr技术

8、 正常情况下两个基团的空间距离很近，荧光基因因淬灭而不能发出荧光。

荧光定量pcr 荧光定量pcr技术

9、PCR扩增时，引物与该探针同时结合到模板上，探针的结合位置位于上下游引物之间。

10、 当扩增延伸到探针结合的位置时， Taq酶利用5'外切酶活性，将探针5'端连接的荧光分子从探针上切割下来，从而使其发出荧光 。

11、检测到的 荧光分子数与PCR产物的数量成正比 ，因此，根据PCR反应体系中的荧光强度即可计算出初始DNA模板的数量。

12、 TaqMan探针技术 解决了荧光染料与非特异性扩增结合的问题 ，反应结束后无需通过熔解曲线检测，缩短了实验时间。

13、 TaqMan探针技术的优点： 荧光背景低； 敏感性高； 杂交稳定性高； 荧光光谱分辨率好； 特异性高。

14、 TaqMan探针技术的缺点： 成本高； 设计难度大； 只能用于检测产物长度低于150bp的反应。

15、 由于TaqMan探针的高特异性，可用于等位基因的辨别，特别适用于人类基因多态性以及根据SNP区别和定量菌株。

本文到这结束，希望上面文章对大家有所帮助。