cdna是单链还是双链（cdna是单链吗）

如何构建部分基因文库？

简单的说,就是把表达的mRNA先反转录为再形成双链DNA,然后克隆到质粒.

pcr技术的酶是什么？

Taq酶是从水生栖热菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。一般常用的Taq酶可以分为rTaq酶和LTaq酶两类，LTaq酶的保真性更强，耐热性也比rTaq酶好。
对于PCR的应用有里程碑的意义，PCR循环包括变性（90 °C左右）、退火（50°C左右）、延伸（70°C左右），每一步对温度的要求都不一样，多数酶在高温时即变性失活，然而该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，所以不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷。同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

1、DND聚合酶——又称DNA依赖的DNA聚合酶

它是以DNA为模板，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一类酶。DNA聚合酶根据聚合酶活力特征和外切酶活性特征的不同，有可以分为多种。在IVD领域中比较常见的酶如下：

Taq DNA聚合酶——Taq DNA聚合酶是第一个被发现的热稳定DNA聚合酶，分子量65kD，从Thermus aquaticus中分离出来，是目前科研和分子诊断试剂盒里最为广泛应用的聚合酶。为了更优化PCR反应体系，Taq DNA 聚合酶被进行了一系列的性能提升和优化，其中最为熟知的就是热启动Taq酶.

热启动Taq酶：该酶被进行了化学修饰、抗体修饰或者配体修饰。无论是哪种修饰，其原理都是：在反应体系加热至高温之前，Taq DNA 聚合酶活性被“修饰”抑制，进而抑制低温条件下的非特异性扩增。另外，还有一系列突变体Taq DNA聚合酶被筛选出来以满足耐镁离子、耐盐、高保真等要求。

Bst链置换DNA聚合酶——Bst DNA聚合酶是来源于 Bacillus stearothermophilus的DNAPolymerase I，经基因工程改造去除了其 5’-3’核酸外切酶活性，但保留了 5’-3’ DNA 聚合酶活性和强链置换活性。同时，该酶在扩增速度、产量、耐盐性和热稳定性等方面均有大幅提高，而且增加了dUTP耐受性，非常适合于防污染的等温扩增反应，如 LAMP 等。

由于此次新冠的影响，Bst成为IVD领域内又一个DNA聚合酶宠儿。

除了Bst外，还有其他类似功能的链置换DNA聚合酶，如如Bca best聚合酶、 Klenow聚合酶、phi29DNA聚合酶等。

Tth DNA聚合酶——Tth DNA聚合酶来自Thermus thermophilus HB8，其最有趣的现象是：在Mg2+条件下，Tth DNA聚合酶具有较强的DNA聚合酶活性。在Mn2+条件下，Tth DNA聚合酶具有更强的反转录活性。这一特性使得Tth DNA聚合酶搭配相应的buffer可以同时对DNA模板和RNA模板进行扩增。

2、逆转录酶——又称为RNA依赖的DNA 聚合酶

该酶以RNA为模板，按5'-3'方向合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA (complementary DNA，CDNA)。最常用的逆转录酶为M-MLV和AMV。

3、RNA聚合酶——一条DNA链或RNA为模板的聚合酶

也称为转录酶。最为常见的是T7 RNA聚合酶，分子量约99kDa。专门催化5'→3'方向的RNA形成过程。目前体外诊断中，SAT技术中会看到RNA 聚合酶的身影。如仁度、中帜的RNA扩增方法中就需要使用RNA聚合酶。

4、蛋白酶K——能够酶解样本中的各类蛋白质的酶

蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，在较广的pH范围（4〜12.5)内及高温 (50〜70°C)下均有活性，EDTA等螯合剂或SDS等去垢剂均不能使之失活。用于质粒或基因组DNA、RNA的分离和抽提。在病毒核酸检测中，蛋白酶K是病毒采样液中的重要组分之一，蛋白酶K可以裂解病毒的外壳蛋白并使其失活，同时将病毒基因组释放以便后续进行核酸抽提。

5、UDG酶——高效控制PCR残余污染

尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG酶），这种酶也称为尿嘧啶 -N- 糖基化酶或UNG酶。

cdna是单链还是双链（cdna是单链吗）

因PCR是一种极敏感的扩增技术，易受污染的影响。小量的外源 DNA 污染可以与目的模板一块被扩增。卫生部明确规定，凡是用于临床检验的PCR试剂，都应该有UNG酶技术，以防止污染。由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。

UDG酶的作用原理：在PCR产物或引物中用dU代替dT或者。这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。

热敏性UDG: 除了常规UDG外，现在也开发出热敏型UDG，热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)是来源于嗜冷海洋细菌经大肠杆菌表达纯化的的重组蛋白，又称南极热敏UDG，热敏型UDG在50℃ 5min即完全失活。大肠杆菌来源的尿嘧啶-DNA 糖基化酶较为耐热，经95℃10min处理仍会残留有少量的尿嘧啶-DNA 糖基化酶活性，导致含有dU碱基的PCR产物的降解。

6、限制性核酸内切酶——识别并剪切特定的脱氧核苷酸序列

限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。

常用的酶，如BsoB I, Hinc II，Nt.BstNBI切刻内切酶。其中，BD公司的链置换扩增术(stranddisplacement amplification,SDA)等温PCR系统中选择的酶需具有切割位点专一性，且对识别位点的化学修饰敏感。新冠疫情中Abbott 的明星产品ID NOW等温PCR系统中，就采用Nt.BstNBI内切酶。

7、解旋酶，helicase——使双链DNA变成单链DNA

利用ATP水解提供的能量来解开双链DNA核苷酸配对形成的氢键，从而形成单链DNA；

常用解旋酶：大肠杆菌的UvrD和T7噬菌体的gp4；大肠杆菌解旋酶II（UvrD），其解链速度是20bp/s，对反应速度有很大的制约性。T7噬菌体的解旋酶gp4解旋酶的解链速度更快，可达400bp/s，可以大大提高反应速度。

目前，Quidel等温PCR系统HAD中采用此酶

PCR技术中所用的关键酶是DNA聚合酶，一般用Taq，后续陆续发展出高保真的pfu酶，以及改造过兼具高速和高保真的Fusion酶等。

cdna文库原理？

经典cDNA文库构建的基本原理：用（dT）作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得cDNA文库。

cdna是单链还是双链（cdna是单链吗）

其基本步骤包括：

（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA文库的关键步骤之一。

（2）cDNA第一条链的合成。

（3）cDNA第二条链的合成。

（4）双链cDNA的修饰。

cdna是单链还是双链（cdna是单链吗）

（5）双链cDNA的分子克隆。

（6）cDNA文库的扩增。

（7）cDNA文库鉴定评价。

3型胶原蛋白如何合成？

巴赫复欣重组人源III 型类人胶原蛋是通过生物工程技术将人体胶原蛋白的mRNA逆转录成cDNA，使用生物细胞的总mRNA 为模板，用反转录酶合成互补的双链 cDNA ，然后嫁接接到载体上，转入到宿主后建立的基因文库就是c生物体内的各种功能蛋白质和酶都是同相应的结构基因编码的,经酶切后的一段基因重组于（大肠杆菌）内，经过高密度发酵、分离、复性、纯化，酶切工艺生产的一种高分子生物蛋白。

为什么将mrna反转录成cdna？

<提取、分离纯化 从真核生物的组织或细胞中提取通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链,将双链cDNA和载体连接,然后转化扩增, 即可获得cDNA文库,构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA和相应基因组DN

pcr诱变原理？

<全称多聚酶链式反应，原理是DNA的体外扩增。具体来说：在EP管里加入DNA、合成原料（dNTP、引物）、耐热的DNA聚合酶（taq）后，放入PCR仪，PCR仪会利用升温使DNA变性，在聚合酶的作用下使单链复制成双链，进而达到基因复制的目的。用途：

1、核酸的基础研究：基因组克隆2、不对称PCR制备单链DNA用于DNA测序3、反向PCR测定未知DNA区域4、反转录）用于检测细胞中基因表达水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的、荧光定量PCR用于对PCR产物实时监控6、cDNA末端快速扩增技术7、检测基因的表达8、医学应用：检测细菌、病毒类疾病；诊断遗传疾病；诊断肿瘤；应用于法医物证学