实时荧光pcr（实时荧光pcr阳性是什么意思）

本文目录一览：

• 1、实时荧光定量PCR可以用来精确测定DNA浓度吗
• 2、什么是实时荧光定量PCR，检测指标是什么？
• 3、实时荧光pcr已运行的室温要求
• 4、实时荧光定量PCR的原理
• 5、实时荧光PCR仪哪家牌子好

实时荧光定量PCR可以用来精确测定DNA浓度吗

实时荧光定量PCR可以用来精确测定DNA浓度吗

实时荧光定量PCR不是用来测浓度的，可以用来做基因的拷贝数。但是如果你的产物单一，有相应的标准品，也是可以测浓度的，浓度的准确性和你的标准曲线相关。

实时荧光定量PCR：

实时荧光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧游标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时线上监控反应过程，结合相应的软体可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。

检测指标是：各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

精确测定DNA浓度的方法：

DNA纯度和浓度的检测:分光光度(紫外吸收)法

1.预热紫外分光光度计10-20分钟。

2.取所需的比色杯（4ml），其中一只装入3 mlH2O溶液，作为空白液，用来校正分光光度计零点及调整透光度至100。

3. DNA纯度及浓度的测定：

①取3微升的DNA样品加入比色杯，加dH2O至3000微升，混匀。

②将比色杯置入分光光度计中，调入射光波长，分别用空白溶液调整零点（T为100，OD为0），测待测样品在260nm、280nm、230nm的OD值。

③计算浓度：

DNA浓度（ug/ml）=A260×50ug/ml×稀释倍数

对于双链DNA 1.0 OD260=50 ug/ml

对于单链RNA 1.0 OD260=40 ug/ml

4. 纯的DNA溶液其OD260/OD280应为1.8，OD260/OD230应大于2.0。

⑴ OD260/OD280大于1.9时，说明有RNA污染，小于1.6时表明有蛋白质或酚污染。

不是用来测浓度的，可以用来做基因的拷贝数。测浓度最经典的还是紫外分光光度计，当然会有偏差，不过总体来说还是可以的。也可以用酶标仪。

实时荧光定量pcr就是qpcr吗

实时荧光定量PCR（qPCR）用什么试剂盒比较好 加入荧游标记探针，巧妙地把核算扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，借助于荧光讯号来检测PCR产物。一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每回圈一次就收集一个数据

实时荧光定量pcr与荧光定量pcr一样么?这里的实时是什么意思

是一样的，所谓的实时就是在仪器上可以随时观察pcr产物的扩增的情况。一般也叫实时定量PCR

实时荧光定量PCR注意事项

1. 按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可开启定量PCR的收集软体，进行实验。关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭讯号收集软体，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。

2. 应该定期备份您的实验资料，备份频率推荐每周一次，用光碟烧录。同时您也应该备份定量PCR仪的各种纯荧光光谱校正档案、背景档案和安装验证实验资料，这些档案所在的目录是C：/Appliedbiosystems/SDS Document。

3. 良好的实验室环境有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。推荐做到以下几个方面：

电源：推荐配备合适的UPS或稳压器。

通风：仪器的通风应该没有阻挡。

温度：推荐实验室配备空调，温度应该控制在10-30°C之间。

溼度：20-80%；对于潮溼的省份，推荐实验室配备除溼机。

空间：易于操作，安全。

4. 怎样判断定量PCR仪的样本加热块是否被污染？怎样清除污染

一个办法是执行背景校正反应板，当一个或多个反应孔连续显示出不正常的高讯号，则表明该孔可能被荧光污染物。另外一种办法是在不放任何物品到样本块上的前提下，执行ROI的校正，当某个孔的讯号明显高出其他孔时，则表明该孔被污染。

清除样本加热块污染的步骤如下：用移液器吸取少量乙醇并滴入每个污染的反应孔中。 吹打数次。 将废液吸入废液杯中。重复以上步骤：乙醇三次，去离子水三次。确认反应孔中的残留液体蒸发完。

biorad实时荧光定量pcr多少钱

采用SYBR Green I 嵌合荧光法进行Real Time PCR 的专用试剂，用本制品进行Real Time qRT-PCR 可在同一反应管内连续进行。反应过程中无需开启管盖新增试剂并可对扩增产物进行实时检测，避免了污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率。非常适合于微量RNA 尤其是微量RNA病毒的检测。本试剂盒包括最适合Real Time PCR的突变改造M-MuLV H Minus逆转录酶(TRUEscript RTase)、热启动HotMaster Taq DNA聚合酶和RNasin抑制剂mix、同时包含适用于逆转录和PCR扩增的优化独特反应体系。本酶M-MuLV(RNase Hˉ)的RNase H活性缺失，与M-MuLV 相比，具有更强的延伸能力和稳定性。同时该酶提高了耐热性，可以在42-50℃反转录，提高了复杂二级结构，GC含量丰富模板反转录效率。而采用优质热启动酶HotMaster Taq DNA Polymerase可以最大限度的减少PCR扩增全程中的非特异性扩增产物产生，大大提高了荧光定量PCR反应的精确性。本制品可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量检测，重复性好，可信度高。

适用范围：适用于高拷贝、低拷贝基因检测；部分高GC含量或具有复杂二级结构的RNA模板。杭州昊鑫生物的，大概50次的900块钱左右.

Thermo Scientific的PikoReal实时荧光定量PCR仪好用吗

还可以。Termo，Biored，罗氏的定量PCR仪都挺好用的，也属于高阶品牌。

实时荧光定量pcr结果2.83e+08

对於乙肝病毒的DNA化验来说，不能不算是高科技。但是所出的结果却不能用来描述病情的程度。

这里有两个概念必需先说明。第一是乙肝患者，乙肝是乙型肝炎的简称，关键词是肝炎。而肝脏要是发炎了，病人一定是会有不舒服的表现的。第二是乙肝病毒携带者，乙肝病毒携带者的肝脏并没有发炎，也就是说与正常人一样，没有什么不舒服的表现。于是乙肝患者与乙肝病毒携带者的主要区别就是看肝脏是否发炎。请简单的想一下，肝脏没有发炎不就是没有病呀。所以只有乙肝患者需要治疗，而乙肝病毒携带者由于不处于疾病状态之下，再说了，对於乙肝病毒携带者来说，有许多人可能化验DNA数值要比你的结果高许多。可是由于肝脏并没有发炎，所以不需要进行任何的治疗。

实时荧光定量pcr结某1.83e十02

一般是代表每毫升样品中有183个目的拷贝。但是这个数字是不准确的，已经在检测限以下了

什么是实时荧光定量PCR，检测指标是什么？

实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量，在扩增过程中，荧光信号随着PCR产物的增加而增强。我们实验室使用的BIOGHSC

Super

Probe

Kit

PCR实验检测DNA,测得的循环数在28左右，整个PCR过程有4个阶段，基线期---指数增长期---线性增长期---平台期，指数增长期内，PCR有高度重复性，一般的检测指标是看线性图谱的扩增曲线的起跳值（CT值）。

实时荧光pcr已运行的室温要求

荧光pcr已运行的室温要求。

实时荧光定量PCR技术具有特异性强，有效解决了PCR污染问题、自动化程度高等特点，做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定Ct值，从而根据Ct值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。

技术流程。

一、RNA的提取。

二、DNaseI消化样品RNA中的DNA。

三、RNA琼脂糖凝胶电泳。

四、RNA反转录为cDNA。

Real-TimePCR引物设计的要求。

Tm=55~65℃。GC=30~80%。PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80~300bp之间都可。引物的退火温度要高，一般要在60℃以上。

实时荧光定量PCR的原理

所谓实时荧光定量PCR技术 ，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

检测方法

1.SYBRGreenⅠ法：

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

SYBR定量PCR扩增荧光曲线图

PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性）

2.TaqMan探针法：

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

服务流程

1.客户认真写好订单，提供待检基因相关信息；

2.签订技术服务合同，支付预付款（30-50%)；

3.设计合成定量PCR引物（或客户提供文献引物委托本公司合成）；

4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反转录；

5.PCR预实验，主要检测引物的特异性和扩增效率；

6.正式定量实验：对所有样品上机检测；

7.实验结果和数据分析，形成报告。

收费标准

优惠包干价：120元/样/基因（SYBRgreenI法，相对定量）

（含RNA提取，反转录，引物合成费用，上机测试费用（3个重复）；一个内参免费（内参3个重复） Ct值（Cycle threshold，循环阈值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数

（如图1所示）。

1. 荧光阈值（threshold）的设定

PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省（默认）设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15

2. Ct值与起始模板的关系

每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式如下。

Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)

n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。

起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：

1. TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。

2. SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。

3. 分子信标：是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光 。 1．传统定量PCR方法简介

1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。

2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。

3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。

2．内标在传统定量中的作用

由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。

3．内标对定量PCR的影响

若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。 实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：

1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。

外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。 各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。

由于qPCR是实时定量检测致病病原体基因核酸，因此它比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具独到优势。

实时荧光PCR仪哪家牌子好

我推荐西安天隆自己研发的PCR仪。有基本型、梯度型、实时荧光定量等多种型号。最重要的是天隆已经在该领域有十多年的经验，是最早研发生产PCR仪的公司之一。

西安天隆生产民族品牌PCR仪已有十年历史，是国内唯一具有定性、终点定量、实时定量PCR仪三个医疗器械注册证和CE认证的民族品牌。其生产的PCR仪在国产同类产品中累计销量第一。也是国家强制性行业标准2006年实施以来首家通过检测并获得SFDA注册证的国产实时PCR仪。实时PCR仪国家发明专利（ZL2004.1.0073432.1）已获授权，产品已获省部级科技成果二等奖及国家重点新产品证书，以PCR为代表的实验室设备已出口韩国、巴基斯坦、沙特等多个国家。

03年以来，西安天隆利用其自身的研发实力与西安交通大学、浙江大学、德国威廉港大学、中科院电子所等产学研协作，相继承担了西安市、陕西省重大技术创新及国家中小企业创新基金等多项科研项目，如“公共场所特定病毒（如SARS）快速采样及定量分析评估系统”；“柔性照明低误差芯片阅读仪”（国科发计字[2004]460号）；“用于疾病分子诊断的实时荧光定量PCR核酸检测仪及配套试剂的产业化（2007ZKC06-05）”等。公司已成为西安市高技术产业化示范工程和西安市生命科学仪器工程实验室。2007年底又传来喜讯，西安天隆科技有限公司牵头承担的重大疾病PCR分子诊断仪国家重点研究项目已获国家批复，以上充分证明了西安天隆在我国生物医学仪器研发及产业化中的主导地位。

PS:进口的仪器是很贵，现在国内的水平也不错，都是经过反复验证的。我们要相信国产的东西会越来越好滴~